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    小保方氏が12月27日に移植したテラトーマからAcr-GFPが検出されたので、調査委員会はこのテラトーマはES細胞FES1に由来する可能性が高いとしている。

    しかし、混入偽装犯が移植したのはキメラ胚から作ったSTAP幹細胞だったと思われる。Letter論文Extended Data Fig.1aにキメラ胚の写真が掲載されているが、これと同じものである。

    letter-Exfig1.png

    調査委員会は論文ではB6GFP(CAG-GFP)×129/Svと書かれているが、129/Sv×B6GFPの間違いだとし、このキメラ胚は4Nキメラ胚で2011年11月28日に撮影されたものだという。

    STAP幹細胞FLSが作られたのは2012年1月31日から2月1日にかけてであるから、この129B6F1キメラはそれより早い。

    FLSと同じ1月31日にはSTAP幹細胞FLBも作られている。どうして同じ日に2種類のSTAP幹細胞があるかというと、作製方法が違うからである。FLBはキメラ胚から作られ、一方、FLSはSTAP細胞から直接作られた最初のSTAP幹細胞だったと思われる。これについては「SpermEgg Journal Club」に次のようなコメントがある。

    たとえば細胞の樹立がなかなかできず、STAP細胞を注入したキメラ胚を使って初めて樹立に成功したデータは、当初それだけで論文にするつもりでしっかりした表と解析を行っていたのですが、途中から直接簡単に樹立できるようになり、葬り去られました。

    論文にはB6GFP(CAG-GFP)と書かれているが、実際には岡部B6マウス(Acr/CAG-GFP)にすり替えられ、129B6F1(Acr/CAG-GFPヘテロ)のSTAP幹細胞であったろう。これはFLSと同じだから調査委員会はFES1由来といったのである。

    このキメラ胚のSTAP幹細胞を移植したなら、テラトーマにホストマウスの組織が見つかったことが説明できる。

    2013年6月、GRASに持ち込まれたFI幹細胞(FI-SC3)はOct4-GFPのFI幹細胞に別のTS細胞(CD1)が混じっているとされたが、これはおそらくこういうことであったろう。

    初期胚の細胞は胚盤胞期になると、栄養芽層と内部細胞塊の細胞集団に分かれ、内部細胞塊からES細胞を、栄養芽層からTS細胞を作ることができる。また、TS細胞はES細胞と同様、クローン胚で作ることも可能である。FI幹細胞を作るため、CD1をホスト胚にしてOct4-GFPのB6マウスのSTAP細胞でキメラ胚を作り、この栄養芽層を培養したと思われる。この結果、Oct4-GFPのSTAP細胞がFI幹細胞に、ホスト胚のCD1がTS細胞になり、これを選別せずにそのままGRASに持ち込んでしまったということだろう。

    もし、ICRマウスをホスト胚にしてAcr/CAG-GFPのSTAP細胞で4Nキメラ胚ををつくり、その内部細胞塊を培養すると、同じようにAcr/CAG-GFPのSTAP幹細胞とICRのホスト胚のES細胞が混在するはずだ。

    なぜなら、小保方氏の保存リストのFLBには全て「Sort」(選別)という文字があり、4Nと書かれたFLBも例外ではないからだ。4Nキメラは全て注入した細胞でできると言われるが、実際にはホスト胚の細胞も混じるに違いない。4Nでわざわざ「Sort」しているのはそのためだと思われる。

    このような細胞株をヌードマウスに移植するとSTAP幹細胞の部分はAcr-GFP陽性になり、ホスト胚のES細胞部分はGFP陰性となる。これがテラトーマの組織でGFP陽性細胞と陰性細胞組織がなめらかに連続している理由である。

    桂調査委員会はGFP陰性細胞が見つかったのをもって、それはホストマウスの組織だといっているはずだ。GFP陰性細胞のDNAを詳細に調べればヌードマウスの細胞ではなく、それらはICRの組織だと分かったはずである。

    2017.04.25 Tue l STAP細胞事件 l コメント (12) トラックバック (0) l top
    昨年の2月、「「STAP細胞事件」-テラトーマの怪」で、小保方氏がヌードマウスにOct4-GFPのSTAP細胞を移植して渡米している間に、混入偽装犯がAcr/CAG-GFPのSTAP幹細胞を被せて移植し、テラトーマを作ったのではないかと書いた。

    最近、その推測は正しかったことを阿塁未央児氏のツイッターで知った。そのツイッターには調査委員会の論文「STAP cells are derived from ES cells」にテラトーマからOct4-GFPが検出されていることが書かれていた。

    Fig.1dには、テラトーマの別々の切片2つ(レーン1と2)と陽性対照群としての3種類のSTAP幹細胞FLS4(レーン3)、ES細胞129B6F1 ES5(レーン4)、STAP幹細胞GLS13(レーン5)、陰性対照群としてのB6マウス(レーン6)の試料から検出されたAcr-GFPとOct4-GFPの検出量が、Il2(インターロイキン)遺伝子の検出量を2コピーとして掲載されている。

    テラトーマのqPCR

    この図でレーン1のテラトーマからは約30コピー(Il2の検出量を2コピーとしているので目盛15は30コピーになる)のAcr-GFPが検出され、同時にOct4-GFPが1コピー検出されていることが分かる。つまり、1つのテラトーマの切片からAcr-GFPとOct4-GFP、両方検出されているのだ。

    Acr-GFPとOct4-GFPが共挿入されたトランスジェニックマウスは若山研にはなく、そのようなES細胞、STAP幹細胞も存在しない。このため、小保方氏がヌードマウスにOct4-GFPのSTAP細胞を移植したというのは紛れもない事実で、その結果、定量PCRで検出できるレベルのテラトーマが作られていたことになる。そしてその同じ試料からAcr-GFPが検出されているのは、そこにAcr-GFPを持つSTAP幹細胞も移植されていたということだ。

    小保方氏に悪意を持つ人間が小保方氏のいない間に、テラトーマ実験をこっそり妨害していたという痕跡がしっかり残っているのである。

    2017.04.21 Fri l STAP細胞事件 l コメント (3) トラックバック (0) l top
    若山氏が論文を撤回しようとする態度には違和感を覚えた。以前、「「キメラマウスの写真の取り違い」は本当か?」で、キメラマウスの写真に取り違いなどなく、これは論文を撤回したいがための方便であると書いたが、なりふり構わず論文を撤回しようとしたのは、マウスのコンタミが明らかになるだけではなく、動物保護団体「PEACE」の存在があったからではないかと思う。

    「PEACE」は理研に「STAP細胞論文の動物実験計画書についての質問書」を2014年5月9日に送ったことをブログに掲載している。理研では動物実験を行うときには、あらかじめ「動物実験計画承認申請書」(以下、「申請書」)を所長に提出し、所長は審査委員会の意見を聴いた上で承認することになっている。「PEACE」は次の理由から、STAP細胞実験が事前の承認なく行われていたのではないかと質問したのである。

    STAP論文に関する動物実験計画書は承認番号「承AH23-02」(2011年10月1日~2013年3月31日)と「承AH25-03」(2013年12月9日~2015年3月31日)の2つあるが、「4月9日に開かれた記者会見に関する補充説明」には、承認された2011年10月4日以前に実験を行っていたとみられる記述がある。また、2つの実験計画書には約8か月のブランクがあるが、5月4日の「不服申し立てについての理由補充書(2) 要約版」には、その間も実験が継続されていたことが示唆されている。

    これに対し理研は以下のように回答している。

    今回、質問いただいた「小保方研究員がSTAP細胞作製実験を行うことのできる動物実験計画書」としては、以下の4件となります。

    (ⅰ)「核移植によるクローン個体作出方法の検討並びに核の初期化機構の解明」
    (2012年4月1日~2013年3月31日)承認番号「承AH14-13」動物実験責任者若山照彦
    (ⅱ)「生体内・生体外ストレスによる体細胞のリプログラミングおよびそのメカニズムの解明」
    (2011年10月1日~2013年3月31日)承認番号「承AH23-02」動物実験責任者若山照彦
    (ⅲ)「マウス初期胚からの神経前駆組織の培養とトランスジェニック動物等による神経分化制御遺伝子の機能解析」
    (2012年4月1日~2014年3月31日)承認番号「承AH14-07」動物実験責任者笹井芳樹
    (2002年6月28日承認より継続している計画になります。)
    (ⅳ)「生体内・生体外ストレスによる体細胞のリプログラミングおよびそのメカニズムの解明」
    (2013年12月9日~2015年3月31日)承認番号「承AH25-03」動物実験責任者小保方晴子

    Harvard大から若山研への客員研究員として、最初は(ⅰ)の実験計画のもとで予備的検討が行われ、研究の本格化とともに(ⅱ)の実験計画が申請され、若山TLの山梨大への移動にともなって論文reviseのための実験は笹井研で行われたため(ⅲ)の下で動物実験がなされ、revise実験終了と自らの研究室の立ち上げとともに(ⅳ)の動物実験計画が申請されたという流れになります。

    小保方氏が客員研究員となったのは2011年4月であるから、(ⅰ)は初期のSTAP細胞実験には該当しない。この「申請書」は以前、紹介した、1匹のドナーマウスから581匹のクローンマウスを作り出すことに成功と発表された論文(承認番号AH14-13-19と書かれている)に関するものである。承認番号はAH14で始まっているので、平成14年(2002年)から継続されており、STAP細胞の予備実験は2011年版の「申請書」に基づいて行われたと理研は言いたかったのであろう。

    これらの「申請書」で使用申請されているマウスは以下の通りである。
    ・(ⅰ)申請マウス:ICR(2000匹)、BALB/c(50匹)、129/Sv(50匹)、DBA/2(50匹)
       C3H/He(50匹)、C57BL/6(50匹)、B6D2F1(4500匹)、Tg GFP(50匹)
       Tg DsRed(50匹)、Tg CENP-I-GFP,CENP-0-GFP,CENP-50-GFP(30匹)
    ・(ⅱ)申請マウス:ICR(100匹)、C57BL/6(50匹)、BALB/c-nu/nu(50匹)
       Tg Oct-GFP(50匹)
    ・(ⅲ)申請マウス:開示されていない
    ・(ⅳ)申請マウス:ICR(10匹)、C57BL/6(10匹)、BALB/c-nu/nu(5匹)、
       Tg Oct-GFP(50匹)

    一方、ArticleとLetterに書かれているマウスは以下である。
    ・論文マウス:B6GFP(cag-gfp)、129/Sv、DBA/2、ICR、 NOD/SCID、C57BL/6
       Tg Oct-GFP

    そして、「あの日」には当初からOct4-GFPマウス(GOFマウス)を使用していたことが書かれている。

    女子医大やハーバード大では実験に使用するマウスは必要な数を業者から購入していたが、若山研ではメスとオスを交配させて繁殖させ、実験に必要なマウスの系統を維持していた。Oct4-GFPマウスも若山研で繁殖させていて、若山先生がテクニカル・スタッフの人に「小保方さんが実験に使えるようにOct4-GFPマウスの数を増やすように」と指示を出してくれた。そのおかげで十分な数のOct-GFPマウスを実験に使用できるようになり、Oct4-GFPマウスの組織から細胞を採取しスフェアを作製する実験を繰り返し行っていた。こうして実験をさせていただいているうちに、若山研にも徐々に慣れていった。

    (ⅰ)の申請マウスで「Tg DsRed」は造礁サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質が組み込まれたマウス、「Tg CENP-」で始まるものはセントメロア(染色体の中央のくびれた部分)にGFPが組み込まれたマウスと思われる。このため、(ⅰ)でSTAP実験が行われていたなら、残った「Tg GFP(50匹)」がOct4-GFPマウスだったことになる。

    しかし、それでも申請マウスと論文マウスで対応のつかないマウスがある。

    (ⅱ)、(ⅳ)のBALB/c-nu/nuマウスは免疫機能のないヌードマウスで、テラトーマの実験用マウスであろう。一方、論文に書かれたNOD/SCIDは同じく免疫不全マウスであるが系統の違うマウスである。木星通信氏が開示した若山研のマウス購入記録にはBALB/c-nu/nuはあるがNOD/SCIDはないので、これはBALB/c-nu/nuの間違いだと思われる。

    問題は、論文にB6GFP(cag-gfp)と書かれている若山B6マウスである。このマウスはいずれの「申請書」にも記載のない未承認マウスである。さらに、桂調査委員会の調査により若山129マウス(CAG-GFP)も使われていたことが明らかになっているが、このマウスも申請されていない。

    若山研ではGOFマウス(Oct4-GFP)、岡部B6マウス(Acr/CAG-GFP)、若山B6マウス(CAG-GFP)、若山129マウス(CAG-GFP)などを飼育している。(ⅰ)で初期実験を行っていたというのは真っ赤な嘘で、購入手続きのいらない若山研の繁殖マウスを申請せずに使っていたと思われる。最初はGOFマウスであり、また、キメラが出来やすいという理由で129B6F1に変えたときは若山129マウスと若山B6マウスである。

    若山研で、理研の設置する「審査委員会」を無視した杜撰なマウスの取り扱いがあったのは明らかで、もし、このような不正行為を「PEACE」が正確に把握していたら、理研の情報公開窓口に言いくるめられることはなかったろう。そのときは、「世界の若山」であるがゆえに、大きなスキャンダルになっていたはずだ。

    「PEACE」はSTAP細胞に関する情報開示請求手続きを開始したのは2014年2月18日だと書いてある。理研は小保方氏の着任当時の実験についても若山氏に確認しているはずで、この動物保護団体の追及に若山氏は大いに困惑したに違いない。若山氏がなりふり構わず論文を撤回させようとしたのは、「申請書」とB6GFP(cag-gfp)の不都合な関係が明らかになるのを恐れたからだろう。

    2017.04.02 Sun l STAP細胞事件 l コメント (13) トラックバック (0) l top
    「あの日」には小保方氏が保管していた試料がなくなっていたことが書かれている。

    若山研にいた頃に作製され、大切に箱に保存していたサンプルのいくつかが、箱の中から消えていたのだ。特に重要な、ほぼすべての組織が初期胚に注入した細胞から形成されるSTAP細胞からの4Nキメラと呼ばれるサンプルのホルマリン漬けなどがなくなっていた。

    STAP細胞からのテラトーマの実験も複数回行われていたが、それらのサンプルもなくなっていた。

    なくなっていたのは、いくつかのサンプルで、残されているキメラやテラトーマもある。それらは調査委員会によって解析され、いずれもES細胞FES1由来の可能性が高いとされている。つまり、小保方氏の試料は解析されていいものと、解析されると困るものが選別されているのだ。

    選別するのには理由がある。STAP細胞は一週齢の仔マウスのリンパ球から作られている。同じ親から生まれても仔がそれぞれ違うように、4NキメラがFLSとは違う仔マウスのSTAP細胞から作られていれば、DNAを調べると同じAcr/CAG-GFPを持つ129B6F1であってもFES1由来でないことが分かり、4NキメラがES細胞の混入なく作られているのが分かるからである。

    2014年2月、論文疑惑が持ち上がったとき、小保方氏が細胞サンプルを廃棄しはじめたので、理研有志が実験室の鍵を付け替えたことがフライデー(2015年1月23日)に掲載されている。実験室の鍵を付け替えると、自由に小保方研に出入りできるので、そこで試料が盗まれたようにみえるが、そのとき既に、試料は抜き取られていたはずだ。

    木星通信氏の取材によれば、若山研が山梨大へ引越した状況(2013年3月)は次のようなものであった。

    リ氏の試料は若山氏が引越終わって「週末には冷凍庫の電気を消すから必要なものはそれまでに運び出すように」と言われて小保方さんが慌てて見に行ったら冷凍庫の自分の棚にリ氏のボックスがあり、残された(要らないもの)と判断したが、自分には捨てる権限がないので居候先の笹井研へ運び、自分の研究室が出来た時にそこへ残す訳にも行かず、そのまま運び込んだ、というのが真相のようです。

    若山研の引越しを小保方氏は知らなかったことが分かる。教えなかったのは犯人が小保方氏の試料を抜き取り、逆に「129/GFP ES」などの「混入偽装」の試料を置く時間が必要だったからである。

    試料は犯人でないと選別できない。つまり、STAP実験が成功し、「混入偽装」を思いついた犯人が、偽装工作をして逐一その成果物を見ていなければ、作製された試料を選別することはできないのである。2014年2月以降の論文疑惑の騒ぎに乗じて、小保方研を封鎖してみたところで、秘密裡に行われたSTAP関連試料を第三者が選別することは不可能なのだ。

    また、試料の廃棄にしても、誰にも気づかれず、冷凍庫の-80度の試料を廃棄するのは簡単ではないだろう。引越しのときであれば、廃棄したい試料を引越しの荷物に加えるだけでいい。引越しが終わったら、ゆっくりと廃棄処分すれば済むのである。

    「混入偽装」は「STAP細胞事件」が起きた前年に投稿したSTAP論文を潰すためのもので、その偽装工作は、AC129のマウスをすり替えたところで終わり、2013年3月の若山研の引越し時の工作で完結していた。2012年のSTAP論文は3誌が全てリジェクトしたので、その工作が表にでることはなかったが、笹井氏が加わったSTAP論文がネイチャーに掲載されたので、それが時限爆弾のように炸裂したのである。

    2012年版のSTAP論文以降の細胞株AC129やFLS-Tも解析されているが、それらは若山研から送付するサンプルをすり替えるだけでいいのである。

    ①STAP幹細胞AC129はES細胞129B6F1ES1由来である
     小保方研にあったのは129B6F1ES2~6の5株であるが、いずれもAC129とは違っていた。そこで若山研にあった129B6F1ES1を取り寄せ、調べると酷似であると分かった。これは犯人がSTAP幹細胞AC129を培養したものをES細胞129B6F1ES1として送っているからである。小保方氏に129B6F1ES1を渡してなかったのは、AC129もいずれ論文に書かれることを想定していたからである。
    ②STAP幹細胞FLS-TはES細胞129B6F1ES1由来である
     FLS-Tは山梨大への移転直前、若山氏が自分でもできるか試しに作ったものである。小保方氏の指導のもと、STAP細胞を自分で作り、そのSTAP細胞から作ったSTAP幹細胞である。これが129B6F1ES1由来と言われたのは、若山研にあったSTAP幹細胞AC129を培養しFLS-Tとして送っているからである。FLS-TはAC129と同じだからES細胞129B6F1ES1由来とされたのである。



    2017.03.21 Tue l STAP細胞事件 l コメント (14) トラックバック (0) l top
    STAP幹細胞FLSはメスの市販129X1マウスとオスの岡部B6マウス(Acr/CAG-GFP)から作られている。しかし、若山氏が実験に使おうとしていたのはメスの若山129マウス(CAG-GFP)とオスの若山B6マウス(CAG-GFP)である。このため、オスメス両方が違っているのである。

    当時、岡部B6マウスは若山研で最小コロニーで飼育されていた。このため、増え過ぎたマウスは安楽死させていたことになる。FLSのオスマウスが岡部B6マウスだったのは、実験で使おうとした若山B6マウスを安楽死させ、安楽死させるはずの岡部B6マウスを使ったからである。

    メスの129X1であるが、このマウスは当時、若山研にはなかったと思われる。元々、129X1マウスは若山129マウスを使う予定で実験には必要なかったからである。

    しかし、「混入偽装」には大田氏のES細胞FES1のメスと同じ129X1マウスが必要であった。そこで、犯人はその129X1マウスをクローンで作ったと思われる。

    この129X1クローンマウスの作成には核移植ES細胞が使われているだろう。若山研で確立されたこの方法は2008年11月4日に下記のように報道発表されている。死細胞の核を移植してクローンを作ろうとしてもうまくいかないが、一旦、核移植ES細胞を作り、できた核移植ES細胞の核を移植すればクローンが出来るという内容である。

    今回、理研CDBの若山清香研究員(ゲノム・リプログラミング研究チーム、若山照彦チームリーダー)らは、16年間凍結保存していたマウスの体細胞を核ドナーに用い、クローンマウスを作成することに初めて成功した。長期保存されていた死細胞の核にも発生に必要な遺伝情報が維持されていることが示された。また、これまで核ドナーに適さないと考えられてきた脳細胞が、凍結保存の場合は最適であることもわかった。この成果は、米科学誌PNASに11月3日付でオンライン先行発表された。

    クローンマウス

    STAP細胞実験が本格化したとき、若山研では別の実験が同時進行していた。2013年3月8日に理研から「1匹のマウスから500匹以上のクローン作出に成功」として報道発表された下記の実験である。そのときの若山研にはクローンマウスを作る環境が整っていたのである。

    理化学研究所(野依良治理事長)は、クローンマウスからクローンマウスを作り出す連続核移植を25世代繰り返し、1匹のドナーマウスから581匹のクローンマウスを作り出すことに成功しました。これは、理研発生・再生科学総合研究センター(竹市雅俊センター長)ゲノム・リプログラミング研究チームの若山照彦チームリーダー(現 山梨大学生命環境学部教授)、若山清香研究員、東京医科歯科大難治疾患研究所の幸田尚准教授、石野史敏教授らの共同研究グループによる成果です。

    この実験のホストの卵子にはDBF1マウスが使われている。DBF1はメスのB6とオスのDBA/2を掛け合わせたものである。この卵子の核を抜いて、移管書の中に記載されている核移植ES細胞129/Sv(129X1のメスだろう)の核を移植すれば129X1のクローンマウスが作れるのである。

    この実験で使われた卵子のミトコンドリアDNAは母親がB6であるからB6である。これからクローンを作れば129X1のメスが生まれても、そのミトコンドリアはホストのままのB6である。母親の129のミトコンドリアがB6なのでFLSのミトコンドリアもB6になったのである。FLSで母親が129だったにも関わらずミトコンドリアがB6だった理由は、129X1がクローンマウスだったことで説明がつくのである。

    2017.03.15 Wed l STAP細胞事件 l コメント (11) トラックバック (0) l top
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