若山氏が論文を撤回しようとする態度には違和感を覚えた。以前、「「キメラマウスの写真の取り違い」は本当か?」で、キメラマウスの写真に取り違いなどなく、これは論文を撤回したいがための方便であると書いたが、なりふり構わず論文を撤回しようとしたのは、マウスのコンタミが明らかになるだけではなく、動物保護団体「PEACE」の存在があったからではないかと思う。

    「PEACE」は理研に「STAP細胞論文の動物実験計画書についての質問書」を2014年5月9日に送ったことをブログに掲載している。理研では動物実験を行うときには、あらかじめ「動物実験計画承認申請書」(以下、「申請書」)を所長に提出し、所長は審査委員会の意見を聴いた上で承認することになっている。「PEACE」は次の理由から、STAP細胞実験が事前の承認なく行われていたのではないかと質問したのである。

    STAP論文に関する動物実験計画書は承認番号「承AH23-02」(2011年10月1日~2013年3月31日)と「承AH25-03」(2013年12月9日~2015年3月31日)の2つあるが、「4月9日に開かれた記者会見に関する補充説明」には、承認された2011年10月4日以前に実験を行っていたとみられる記述がある。また、2つの実験計画書には約8か月のブランクがあるが、5月4日の「不服申し立てについての理由補充書(2) 要約版」には、その間も実験が継続されていたことが示唆されている。

    これに対し理研は以下のように回答している。

    今回、質問いただいた「小保方研究員がSTAP細胞作製実験を行うことのできる動物実験計画書」としては、以下の4件となります。

    (ⅰ)「核移植によるクローン個体作出方法の検討並びに核の初期化機構の解明」
    (2012年4月1日~2013年3月31日)承認番号「承AH14-13」動物実験責任者若山照彦
    (ⅱ)「生体内・生体外ストレスによる体細胞のリプログラミングおよびそのメカニズムの解明」
    (2011年10月1日~2013年3月31日)承認番号「承AH23-02」動物実験責任者若山照彦
    (ⅲ)「マウス初期胚からの神経前駆組織の培養とトランスジェニック動物等による神経分化制御遺伝子の機能解析」
    (2012年4月1日~2014年3月31日)承認番号「承AH14-07」動物実験責任者笹井芳樹
    (2002年6月28日承認より継続している計画になります。)
    (ⅳ)「生体内・生体外ストレスによる体細胞のリプログラミングおよびそのメカニズムの解明」
    (2013年12月9日~2015年3月31日)承認番号「承AH25-03」動物実験責任者小保方晴子

    Harvard大から若山研への客員研究員として、最初は(ⅰ)の実験計画のもとで予備的検討が行われ、研究の本格化とともに(ⅱ)の実験計画が申請され、若山TLの山梨大への移動にともなって論文reviseのための実験は笹井研で行われたため(ⅲ)の下で動物実験がなされ、revise実験終了と自らの研究室の立ち上げとともに(ⅳ)の動物実験計画が申請されたという流れになります。

    小保方氏が客員研究員となったのは2011年4月であるから、(ⅰ)は初期のSTAP細胞実験には該当しない。この「申請書」は以前、紹介した、1匹のドナーマウスから581匹のクローンマウスを作り出すことに成功と発表された論文(承認番号AH14-13-19と書かれている)に関するものである。承認番号はAH14で始まっているので、平成14年(2002年)から継続されており、STAP細胞の予備実験は2011年版の「申請書」に基づいて行われたと理研は言いたかったのであろう。

    これらの「申請書」で使用申請されているマウスは以下の通りである。
    ・(ⅰ)申請マウス:ICR(2000匹)、BALB/c(50匹)、129/Sv(50匹)、DBA/2(50匹)
       C3H/He(50匹)、C57BL/6(50匹)、B6D2F1(4500匹)、Tg GFP(50匹)
       Tg DsRed(50匹)、Tg CENP-I-GFP,CENP-0-GFP,CENP-50-GFP(30匹)
    ・(ⅱ)申請マウス:ICR(100匹)、C57BL/6(50匹)、BALB/c-nu/nu(50匹)
       Tg Oct-GFP(50匹)
    ・(ⅲ)申請マウス:開示されていない
    ・(ⅳ)申請マウス:ICR(10匹)、C57BL/6(10匹)、BALB/c-nu/nu(5匹)、
       Tg Oct-GFP(50匹)

    一方、ArticleとLetterに書かれているマウスは以下である。
    ・論文マウス:B6GFP(cag-gfp)、129/Sv、DBA/2、ICR、 NOD/SCID、C57BL/6
       Tg Oct-GFP

    そして、「あの日」には当初からOct4-GFPマウス(GOFマウス)を使用していたことが書かれている。

    女子医大やハーバード大では実験に使用するマウスは必要な数を業者から購入していたが、若山研ではメスとオスを交配させて繁殖させ、実験に必要なマウスの系統を維持していた。Oct4-GFPマウスも若山研で繁殖させていて、若山先生がテクニカル・スタッフの人に「小保方さんが実験に使えるようにOct4-GFPマウスの数を増やすように」と指示を出してくれた。そのおかげで十分な数のOct-GFPマウスを実験に使用できるようになり、Oct4-GFPマウスの組織から細胞を採取しスフェアを作製する実験を繰り返し行っていた。こうして実験をさせていただいているうちに、若山研にも徐々に慣れていった。

    (ⅰ)の申請マウスで「Tg DsRed」は造礁サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質が組み込まれたマウス、「Tg CENP-」で始まるものはセントメロア(染色体の中央のくびれた部分)にGFPが組み込まれたマウスと思われる。このため、(ⅰ)でSTAP実験が行われていたなら、残った「Tg GFP(50匹)」がOct4-GFPマウスだったことになる。

    しかし、それでも申請マウスと論文マウスで対応のつかないマウスがある。

    (ⅱ)、(ⅳ)のBALB/c-nu/nuマウスは免疫機能のないヌードマウスで、テラトーマの実験用マウスであろう。一方、論文に書かれたNOD/SCIDは同じく免疫不全マウスであるが系統の違うマウスである。木星通信氏が開示した若山研のマウス購入記録にはBALB/c-nu/nuはあるがNOD/SCIDはないので、これはBALB/c-nu/nuの間違いだと思われる。

    問題は、論文にB6GFP(cag-gfp)と書かれている若山B6マウスである。このマウスはいずれの「申請書」にも記載のない未承認マウスである。さらに、桂調査委員会の調査により若山129マウス(CAG-GFP)も使われていたことが明らかになっているが、このマウスも申請されていない。

    若山研ではGOFマウス(Oct4-GFP)、岡部B6マウス(Acr/CAG-GFP)、若山B6マウス(CAG-GFP)、若山129マウス(CAG-GFP)などを飼育している。(ⅰ)で初期実験を行っていたというのは真っ赤な嘘で、購入手続きのいらない若山研の繁殖マウスを申請せずに使っていたと思われる。最初はGOFマウスであり、また、キメラが出来やすいという理由で129B6F1に変えたときは若山129マウスと若山B6マウスである。

    若山研で、理研の設置する「審査委員会」を無視した杜撰なマウスの取り扱いがあったのは明らかで、もし、このような不正行為を「PEACE」が正確に把握していたら、理研の情報公開窓口に言いくるめられることはなかったろう。そのときは、「世界の若山」であるがゆえに、大きなスキャンダルになっていたはずだ。

    「PEACE」はSTAP細胞に関する情報開示請求手続きを開始したのは2014年2月18日だと書いてある。理研は小保方氏の着任当時の実験についても若山氏に確認しているはずで、この動物保護団体の追及に若山氏は大いに困惑したに違いない。若山氏がなりふり構わず論文を撤回させようとしたのは、「申請書」とB6GFP(cag-gfp)の不都合な関係が明らかになるのを恐れたからだろう。

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    2017.04.02 Sun l STAP細胞事件 l コメント (13) トラックバック (0) l top

    コメント

    Re: 岡部マウスの謎
    大田論文では岡部マウスをacro/act-EGFPと書いていますが、これはAcr/CAG-GFPの別名だと思います。
    http://www.informatics.jax.org/allele/MGI:3818317
    2017.04.22 Sat l wamoga. URL l 編集
    岡部マウスの謎
    岡部マウスに3番染色体にアクロシンプロモーターが結合したGFP遺伝子と、CAGプロモーターが結合したGFP遺伝子が入っているものはない。
    こういう書き込みを読んだのでしらべました。
    矢張りありませんでした。
    2017.04.19 Wed l Nonpori. URL l 編集
    No title
    5について

    彼女の実験ノートは聞き書きで後に書き足されている可能性がありますよ。グラススライドの記載もそうです。彼女は手記で経過観察を他者に委ねていてその報告を若山さんにも米国から行っているとしている。このあたりまずは彼女の渡米日はパスポートを見れば分かることですね。
    このテラトーマの問題は、アーティクル記載事項、レター記載事項、ティシュー論文記載事項、博論記載事項、小保方さんの実験ノート記載事項、パラフィンブロックの桂報告分析記載事項、グラススライド記載事項、理研のマウス購入検収記録、笹井さんの証言記録、石井調査時の証言記録、川田龍平議員の質問書記載事項、小保方さんのテラトーマ関係実験はノートによると2011年4月から始まっているという三木弁護士の証言記載事項、の要素を全部細かく調べて横並びで比較検討されなければなりません。
    私の見る限りでは全ての情報の整合はとても難しい。どこかに嘘があるか違う実験との混合がある。もう少し事実の確定が欲しいです。せめて12/27に小保方さんがアメリカに居なかったとか、管理していてくれたのはだれだったとかいう事実確定が欲しいのです。ミッシングリングが多すぎてあり得るストーリーが無限に考えられる。私が現時点でこの問題をペンディングしている理由です。

    以上です。長々と失礼しました。ご参考になれば幸いです。書き込みが迷惑の場合はそうおっしゃってください。私は別の場所で考え続けています。
    2017.04.13 Thu l 閲覧者. URL l 編集
    No title
    4について

    「僕のマウス」の説明は若山さんがFLS等に関してあの記者会見で初めて言い出したことです。2012年に入っての2度目の実験群での話で、今言った2011年の最初の実験時の話ではありません。あなたはこの実験が本当に成功していると思われているのですかね。仮にそうだとして、"驚いた犯人"はこの若山さんの成功を太田ESによるねつ造だということにしようと考えた末にテラトーマに太田ESを注射したのではなく、小保方さんに渡したマウスを岡部マウスとのF1とすり替えたとおっしゃるのですか。
    2017.04.13 Thu l 閲覧者. URL l 編集
    No title
    3について

    89Pに10月頃にGOFでのキメラ作製実験が開始されたとあります。実験は計画表の作製から始めて何度か試みて駄目だった。赤ちゃんマウスを渡されてスフィア完成まで7日です。移植に1日、その安定に1日、仮親の子宮に戻して10日胎児だとしても10日です。何度か試みたというのは移植日が何日かかかったということです。どういう作業かは64P以降の博論時の記述にあります。それを5回と仮定して移植の1日を5日に替えると全体が23日の計算になる。計画表の作製期間及びそれに従ったマウスの準備期間は既に整っているとして入れてません。10月1日開始基準として今10/23ですね。
    この実験は失敗でした。この失敗を確認して後F1の実験がまた計画表の作製からもう一度繰り返されます。これも何度か繰り返し実験を行ったとありますから、11/24からまた23日を経過させると11/16です。これも失敗したのでしたね。ここが細かいことだが最初のF1が失敗していると申し上げた理由です。そして次にナイフ切り分けで成功した。いつものようにスフィアを持っていったらナイフ切り分けでインジェクトした一回の実験として12日かかります。単純計算で11/28ですね。最初の成功は11月ということになってますね。ぎりぎり間に合ってますね。でもGLの樹立日付は11/25です。4Nキメラの撮影は11/28です。マウスの準備期間は入れてない。これが私が日程がタイトと言っている意味です。
    4Nのキメラを撮影した日が11/28だということは2Nも含めたキメラ成功はほぼこの日だと思います。11/25のGLは彼の記載習慣では細胞の培養開始日だということになっている。まずこの時点で、この4Nキメラは少なくとも若山さんの証言によってGFPヘテロだということを再確認されてください。「僕のマウス」ではありませんね。
    あなたのおっしゃる"驚いた犯人"はこの後につまり11/29以降に何かを始めなければなりませんが、若山さんと小保方さんが次に行ったのはテラトーマ実験でしたね。スライドグラスの記載は12/27移植とある。何らかのテラトーマ実験が彼女の渡米期間を含んで行われたのは事実のようですね。これがSTAP問題の核心です。
    2017.04.13 Thu l 閲覧者. URL l 編集
    No title
    1と2について

    若山証言による2011/11/28撮影の4Nキメラは小保方さんがレターのExtended Data Figure 1のaでB6GFPx129と書いているのを、若山さん自身が129xB6GFPだと桂チームに報告しています。ここの問題もアーティクルのExtended Data Figure 7のdと相まって錯綜していますが、GFPに関してのみ言えばヘテロだと言うことを認めているのは本人で第三者ではありません。
    2017.04.13 Thu l 閲覧者. URL l 編集
    No title
    6について
    あなたの注意深さにはいつも驚かされます。これで3度目ですね。私は全く気付かなかった。
    調べた試料は以下で桂報告にも書かれている通りですね。
    Lanes
    1: STAP cell teratoma;
    2: STAP cell teratoma (separately prepared);
    3: FLS4 (Acr/cag-GFP+ STAP stem cell);
    4: 129B6F1 ES-5 (control ES cell);
    5: GLS13 (Oct4-GFP+ STAP stem cell);
    6: C57BL/6NCrSlc mouse;
    7: no template DNA.
    Each value shows fold-amplifications relative to the Il2 gene (see Supplementary Methods).

    Oct4-GFPは勿論5にはっきりと出ていて、これは学生のGOFESのコンタミとされている試料ですから当然ですが、あなたは1にも米粒ほどの高さですがOct4-GFPの存在が示されていると指摘された。考え込まされました。

    このグラフは勿論松崎チームが作ったのですから何かしらの作表上のミスでなければ彼らはここにOct4-GFPがわずかにでも存在していることを知っていたということになります。あなたもご承知の通り、桂報告書には<このテラトーマは、 (1)Acr-GFP 遺伝子を含むが Oct4-GFP 遺伝子は含まないこと、、、 が判明した。>と書かれています。
    存在量が有意であるか否かの基準がIL2の各試料での存在量の程度として右の端に表されていて、1のSTAP cell teratomaが含んでいる量はその1/5程度でしょうか。ど素人なのでこの検出量に関して何かを言うことはできませんが、調べたら出て来たと言うことだけは確かで、逆に全く出て来ない資料もちゃんと存在しているということからは、これは微量でも無視してはいけない事実ではないかと思われます。特に1と2に関しては微量なコンタミが発生しないように実験器具を取り換えて切り出したとされている。1にあって2に無いというのは仮に検出量が有為であるという仮定の下では、同じパラフィンブロックの中で切り出し場所によってはOct4-GFPがなかったことを意味しています。それほどわずかだったということです。
    この12/27テラトーマの中にOct4-GFPが存在していたとしたらそれは小保方さんがGOFマウスのSTAP細胞を一度はPGAに包んで免疫不全マウスの皮下に埋納したものが、全部死滅して分解してしまったのではなく、わずかにでも残されていたという可能性を残します。
    私は桂報告がOct4-GFP遺伝子を含まないと書いていたから、12/27テラトーマに関して、この問題をペンディングしていながらも、小保方さん渡米中に誰かがマウス毎取り替えたのではないか、或いはそもそも小保方さんの実験とは別に並行して行われていたマウスと取り換えられてしまったのではないかという可能すら考えていました。しかし、あなたの指摘された事実が有意な結果であるとしたら、これは小保方さんの実験したテラトーマ上で発生した謎である可能性も残さなければならないようです。
    小保方さんは博論の実験でも、この時はCAG-GFPですが、免染によってドナー細胞のCAG-GFPの発現したわずかなGFP蛋白を検出し、ドナー細胞がテラトーマとして増殖はしていないが、死なずに生き残って散在していたことを報告しています。
    考えさせられます。
    2017.04.13 Thu l 閲覧者. URL l 編集
    Re: No title
    1. 「あの日」には「それにもかかわらず、若山先生はあきらめずに実験を繰り返してくださった。」とあり、その後、塊で注入したらキメラが出来たと書かれています。素直に読むと129B6F1で成功したととれます。
    2.最初、Oct4を使ったのはどうしたら初期化が上手くいくかを見ていたからで、うまく初期化できるようになったので、キメラの作りやすさで129B6F1にした。すると、使うなら「僕のマウス」のCAGホモになるでしょう。
    3.動物実験計画書の提出は9月9日で承認は10月ですが、自前で飼育しているマウスなので、承認を待たずに実験が行われているはずで、時間的にはそれほどタイトでもないと思います。最初の頃、マウスは若山氏が自分で用意していましたがその後、テクニカルスタッフに任せています。これはキメラが出来、若山氏が実験に集中するためでしょう。このため、犯人がマウスをすり替えることが可能になります。
    4.大田ES細胞と同じ組み合わせにして大田ES細胞の混入だと思わせたかったからです。
    5.12/27日はヌードマウスの到着日で実験ノートにもその日にテラトーマを移植したことが書かれています。当初の休暇申請を取り消さず、実験していたと思われます。
    6.BCAのFig.1dの1のSTAP細胞テラトーマにはOct4-GFPが少し出ています。
    2017.04.11 Tue l wamoga. URL l 編集
    No title
    一つの仮説ですね。ここのコメント欄で長々と検討するのもはどうかと思いますので、要点だけ記します。
    1.細かいですが大事なことです。最初のF1ではできていません。次のナイフ切り分けでできた。
    2.最初の成功時マウスが「僕のマウス」であったという証言は誰からもありません。無論、若山さんからもありません。ですからそこは仮説ですね。小保方さんのSTAPキメラ成功時のマウス背景データはExtended Data Figure 7にあります。彼女の認識はGFPヘテロです。マウス背景情報に関して彼女は若山さん以外から知ることができません。実験担当者としての情報提供責任は若山さんにあります。
    3.最初の成功は11月です。12/27移植Harukoまでに次の準備をしなければならない。10月から始められたキメラ実験の手記に掛かれた日程を確認されるととてもタイトだと分かります。最初の成功後に次の実験を行うのは若山さんです。第三者に若山さんの自由意志を変えさせることはできません。第三者にできることはインキュベーター内で細工すること、あるいはおっしゃるようにマウス管理に細工することだけです。
    4.犯人はなぜ若山B6マウスから岡部マウスにすり替えたのでしょうか。そもそも若山さんが最初の成功マウスに「僕のマウス」を使っていたら、それを次の段階でどうしてヘテロに替える必要があるでしょうか。若山さんが行わない実験に第三者は関与することができません。
    5.12/27が彼女の渡米のための長期休暇の最中であることはooboeさん資料でご承知と思います。この確認は彼女が休日出勤したか否かパスポートを提示するだけで証明されます。
    6.桂調査報告のPCRの調査でOct4-GFP人工遺伝子はパラフィンブロックのどこの細胞にも組み込まれて居ないと結論されている。
    7.上記結論が嘘だと判断されるときはこの桂報告の論考全体が嘘と判断されなければなりません。文献学において歴史資料の信憑性を検討するときの方法論の基礎です。都合のいいところだけをつまみ食いするような説と言うのは歴史分野でも多いんです。義経はジンギスカンだったというようなあれです。
    8.あなたがFLS=太田ESの最初の否定者だと言うことは存じています。
    9.ピースはきれいに嵌まっていないと思います。
    2017.04.10 Mon l 閲覧者. URL l 編集
    Re: No title
    129B6F1のSTAP細胞ですがFLSまでに2つあると思います。GOFマウスで作っていたが出来ず129B6F1に変えて初めてキメラが出来たSTAP細胞はおそらく自前の若山129マウスと若山B6マウスで、これが「あの日」に出てくる、最初に成功したキメラでありSTAP幹細胞。この成功に驚いた犯人がこの後、STAP論文を潰す行動にでる。次には129X1と若山B6マウスでキメラが作られ、キメラの写真が11月28日に撮られた。しかし、実際には犯人が若山B6マウスを岡部B6マウスにすり替えていて、アクロシン入りになっていた。そしてこの4Nキメラ胚からSTAP幹細胞も作られていた。12月27日に小保方氏がOct4-GFPのSTAP細胞を免疫不全マウスに移植して渡米すると、犯人はその上からこのアクロシン入りのSTAP幹細胞を重ねて移植した。このSTAP幹細胞はソートしていなかったので、ホスト胚のES細胞も混在していた。そのため、テラトーマは少量のOct4-GFPとAcr/CAG-GFPとGFP陰性の細胞が混在することになった。調査委員会はこのGFP陰性の部分をホストマウスの組織と結論づけた。その後、このSTAP幹細胞の核からクローンマウスが作られ、そのクローンマウスから幹細胞FLSが作られた。


    2017.04.09 Sun l wamoga. URL l 編集
    No title
    マウス業者は黒塗りになっていますね。あなたの推論で示唆されている問題はもっと根深いかも知れませんが今は問わず、「最初はGOFマウスであり、また、キメラが出来やすいという理由で129B6F1に変えたときは若山129マウスと若山B6マウスである。」の部分、若山129マウスの意味するところが129-CAG-GFPなら、そのことは2011/12/27のテラトーマからAcr-CAGが出たことと、その前の2011/11/28の4Nキメラ写真が129xB6-GFPと桂報告が若山さんのヘテロ主張を記載していることと矛盾しますね。NOD/SCIDの論文記載と相まってとても重大なところです。解をお持ちならご教授願いたい。
    2017.04.09 Sun l 閲覧者. URL l 編集
    No title
    BALB/c-nu/nuは無毛、NOD/SCIDは白毛、ですね。
    形態的にも全く違うマウスで小保方さんは博論までは間違いなくNOD/SCIDです。
    もう一段深めた解明を期待します。
    2017.04.04 Tue l 閲覧者. URL l 編集
    No title
    これと関係あるのかな?

    そんな時にアメリカの先生から電話があり、「若山先生が、著者は持っていないはずの自己点検委員会の資料を所持しているようで、それが著者以外から通報されると今後ネイチャーに投稿できなくなるかもしれないので論文の撤回を急ぎたいと言ってきた」という話を聞いた。
    2017.04.03 Mon l 名探偵気取り. URL l 編集

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