「STAP細胞事件」-FLS3にはクローンの痕跡がある

2017/11/20(月) 午前 9:02にTs.Maker氏のブログのコメントに次のコメントが書かれていた。Ts.Maker氏自身のコメントである。

「memo chrM 12,188」

「chrM」とはミトコンドリアのDNAを指し、何かを見つけたのでその地番を12,188とメモ書きしたということであろう。

体細胞は核DNAの他にミトコンドリアに独自のDNA（mtDNA）を持つ。このmtDNAは必ず母親から子に受け継がれ、父親から受け継がれることはない。したがってmtDNAを調べれば、母親、母親の母親、さらに母の母の母と女系を遡ることができる。またmtDNAは組換えが起こらないので、mtDNAに違いがあるとすればそれは突然変異によるということになる。

私はFLS3がクローンマウスの仔から作られていると考えていたので、FLS3がクローンならミトコンドリアは移植先のmtDNA（おそらくICRマウス）になり、ミトコンドリアを調べれば129B6F1の母親側の129マウスとは違う塩基（SNP）が見つかるだろうと思っていた。そこで、このコメントを見て、すぐFLS3のミトコンドリアを見にいった。

IGVで見ると①のようになっていた。これは予想外であった。①のFLS3に塩基AとTが半々ずつ出ていたからである。mtDNAは母親のDNAしか持っていないので、1塩基中に2種類出るとは思っていなかったのである。



しかし、文献「体細胞クローン金華豚、およびその後代産子におけるドナー体細胞由来mtDNAの伝達性」を見ると、次の記述があり、体細胞クローンではドナーとレシピエントのmtDNAが混在すると書かれていた。

体細胞クローンウシでドナー由来のmtDNAが検出されて（Hiendlederら1999；Steinbornら2000）以来、体細胞クローン動物に関しては、伝達割合に差はあるものの、クローン個体内でドナーとレシピエント双方由来のmtDNAが混在する状態（ヘテロプラズミー）と考えられつつある（Takedaら」2000；Inoueら2004）

AとTが両方でるのは、FLS3が体細胞クローンで12,188番のTの塩基はドナーの129B6F1の129系塩基T（②）に、レシピエントのmtDNA（おそらくICRマウスで塩基はA）が混在しているからだと思われる。

調査委員会はFLS3はFES1由来で、FES1は129×B6の受精卵ES細胞ということであった。それなら、mtDNAの12,188は②のように塩基Tで灰色表示されるはずである。作製者の太田氏は作成後、研究には使わなかったというので、突然変異が半分まで蓄積するはずもない。FLS3が受精卵ES細胞でないのは明らかだ。

もし、FES1のミトコンドリアもFLS3と同じなら、桂調査委員会が調べたFES1は太田氏の作成した受精卵ES細胞ではなく、すり替えられ太田氏作製のFES1として調査委員会に提出されていたことになる。逆に、FES1がFLS3と違うなら、それはそれで、FLS3はFES1由来とは言えないことになる。

いずれにしてもこのミトコンドリアの一塩基で桂調査委員会は詰んでいるのである。

「STAP細胞事件」-公共データベースのFI幹細胞（Chip-seq input）にはFLS3と同じ欠失があると思われる

3番染色体と8番染色体にそれぞれ欠失があるとされた範囲のFLS3とFI幹細胞（Chip-seq input）をIGVでみると以下のようになる。

3番染色体の欠失の部分は、



であり、FLS3は欠失部分のリード数がガタンと落ちていることが分かる。本来の2本鎖が1本しか検出されていないからということになる。FI幹細胞の方はChip-seq inputなので、もともとリード数が少なく、何となく少ないかなという感じである。

一方、8番染色体の方も、



で、同じような傾向がみえる。FI幹細胞の方は3番染色体に比べ、少ないのが分かりやすい。

ここで、この２つの欠失部分で129CAG-GFPマウスの特徴的な塩基をピックアップしてFLS3とFI幹細胞と対比したのが次の図である。



3番染色体の欠失部分にある129CAG-GFPマウスの特徴的な箇所（リファレンスの塩基G（黄土色）がAに置き換わって緑色で表示されている箇所）のFLS3とFI幹細胞をみると同じ緑で129の特徴がそのまま反映されている。これは、B6系が欠失だということと辻褄が合う。

一方、８番染色体はというと、



129CAG-GFPマウスでリファレンス塩基が青色のCが赤のTに置き換わっている箇所はFLS3とFI幹細胞は共に灰色（灰色はリファレンス塩基と同じことを表している）である。つまり、129の特徴がないということで、これは129が欠失していることと辻褄が合うのである。

「STAP細胞事件」-やはり、「Chip-seq（input） FI幹細胞に欠失はない」でいいんじゃないか

その後の阿塁未央児（@aruimiouji ‏）氏のツイッターは、STAP論文作成に使用された、「公共データベース登録されたFI-SCのデータには、もしかして欠失はなかったかも？」とトーンダウンしているが、私はポップアップメニューの内容から、やはり、

「Chip-seq（input）のFI幹細胞に欠失はない」

でいいんじゃないかと思っている。

IGVのカバレッジの灰色の部分にカーソルを当てると、ポップアップメニューが現れ、その塩基の地番と種類、およびトータルカウント数が表示される。そのカウント数は＋と-に区分され、それらを合わせるとトータルカウント数に一致するようになっている。

この「＋」と「-」は何を意味しているかというと、おそらく＋鎖と－鎖を意味しているだろうと思う。DNAは二重らせん構造でATGCからなる塩基の二つの鎖がたがいに相補鎖となっているが、該当の塩基がどちらの鎖から読まれたかを表していると思うのだ。

つまり「1＋、1-」であれば、それぞれ＋鎖と-鎖から１本ずつ読み込まれていると思われる。

Acr/CAG-GFP　129B6F1のFES1の8番染色体は129系の欠失があるとされているから、もし欠失があれば、欠失箇所の塩基はすべて＋鎖か-鎖のいずれかで表示され、両方では検出されないことになる。

IGVで調べると欠失があるとされる範囲の塩基はどちらか一方しか検出されないものもあるが、その欠失範囲において一様に＋鎖と-鎖がカウントされており、トータルカウント２以上で＋鎖と-鎖、どちらもカウントされているものがある。従って、欠失とされる範囲に欠失はないということになる。

FLS3を同じように調べるとはっきりするが、手元にないので、とりあえず思いついたことを書いてみた。

» 続きを読む

「STAP細胞事件」-STAP細胞の存在を示す公共データベース（その2）

阿塁未央児氏のもうひとつの興味深いツイッターの内容を紹介しよう。STAP細胞における遺伝子「Eepd1」の発現についてである。



ES細胞の発現量はわずかだが、STAP細胞でははっきりとした発現が見て取れる。興味深いのはこのEepd1遺伝子の機能である。

MGI（Mouse Genome Informatics）という、マウスの遺伝子等に関する様々な情報を提供してくれるサイトがあり、このサイトの検索欄にEepd1と打ち込んで遺伝子情報を調べたのが次の図である。



Biological Process(生物学的プロセス）でresponce to stimulus(刺激に対する応答)の欄にチェックが入っている。「stimulus」、STAP細胞の「S」である。まさに刺激を受けた細胞がその生物学的プロセスとして反応するとき発現する遺伝子なのである。

「STAP細胞事件」-STAP細胞の存在を示す公共データベース

阿塁未央児‏氏の10月26日のツイッターは次のようなものであった。

出ました！。完膚なきまでに、STAP特異的な発現！。STAP-SCもFI-SCもない。ESCもEpiSCもなし！。オマケのDUX+ESCもなし！。

公共データベースの登録データから「Bmper」遺伝子がSTAP細胞しか発現していないのを見つけたとつぶやいていたのだ。そこで、このSTAP細胞とES細胞のRNA-seqデータをダウンロードしてIGVにかけてみた。



①と③のデータはTs.Maker氏、②と④は阿塁未央児‏氏がIGVで扱えるよう加工してアップロードしていたものである。①と②はES細胞のRNA-seqデータで、③と④がSTAP細胞のRNA-seqデータである。

STAP細胞のBmper遺伝子のリード数は472と417あり、かなりな発現量である。対してES細胞は全く発現していない。また、Pou5ｆ1（Oct3/4）はどうかというとES細胞に比べかなり量は低いがはっきりと発現しているのが分かる。



この２つのことから、公共データベースに登録された試料はES細胞を混入させて作ったものでないことは明らかで、STAP細胞そのものだったということになる。

「STAP細胞事件」-公共データベースに登録されたAcr/CAG-GFP 129B6F1のFI幹細胞には3番、8番の欠失がない

公共データベースの解析により、新しい事実が明らかになってきている。公共データベースを専門家でなくても手軽に見えるようにしてくれたのはTs.Marker氏だが、阿塁未央児（@aruimiouji ‏）氏も独自に公共データベースを調べ、注目すべき解析結果をツイッターで発信してくれている。今回はその中の一つを紹介したい。それは、

公共データベースに登録されたAcr/CAG-GFP　129B6F1のFI幹細胞には3番、8番の欠失がない

という驚くべき事実である。

Acr/CAG-GFPの129B6F1といえばES細胞FES1である。このFES1には３番と８番染色体に欠失があり、調査委員会がFES1、129GFP ES、FLS3、CTSを同じ細胞株とした理由はそれらが同じ欠失を持っていたからである。しかし、同じAcr/CAG-GFP　129B6F1でも3番、8番に欠失がないFI幹細胞が公共データベースに登録されていたのである。

桂調査報告書に8番染色体の欠失は次のように書かれている。



また、公共データベースに登録されたChip-seqのFI幹細胞は調査委員会で以下のようにAcr/CAG-GFP　129B6F1だとされていた。



阿塁未央児（@aruimiouji ‏）氏はこのFI幹細胞には欠失がないというのである。そこで、このChip-seq（iｎput)のFI幹細胞をTs.Marker氏がアップしたファイルからダウンロードしてIGV（Integrative Genomics Viewer）にかけてみた。



塩基配列が分かるよう、欠失があるとされた23,265,639番の直前23,265,629番から23,265,700番までを表示させている。下段のSequenceと書かれたところに塩基配列のレファレンスが表示されており、調査報告書で示された欠失直前の塩基配列と同じ塩基配列が表示されているのが分かる。

SRR1171569.bam Coverage（FI幹細胞）と書かれたところに灰色のブロックがあるが、これが検出された塩基を表し、小さいブロック1個が1塩基で、灰色なのはリファレンスの塩基の種類と同じものが検出されていることを表している。

つまり、このIGVは23,265,629番以降で塩基CAACCATCCATが検出され、その後リファレンス通りのATCCCCTCTTCAが検出されていることを示している（ブロックが大きくなっているのは、同じ塩基が2個カウントされたということである）。

従って、このFI幹細胞には調査委員会がいう８番染色体の欠失がなく、ES細胞FES1由来ではないFI幹細胞となる。では、桂調査報告書でこのFI幹細胞についてはどう書かれているかというと次のとおりである。

論文や公共データベース登録内容に基づくと、これらの解析に用いている細胞株はCD45+細胞、TS 細胞を除いて 129xB6 ヘテロ系統マウス由来であり、挿入されている GFPのタイプは CAG もしくは Oct4 である。しかし、ChIP-seq input データの解析から、FI幹細胞は Acr-GFP/CAG-GFP が挿入された 129xB6 へテロ系統、CD45+細胞は Oct4-GFP が挿入された B6 ホモ系統、STAP 細胞, STAP 幹細胞は CAG-GFP が挿入された 129xB6 へテロ系統由来であることが強く示唆された。

欠失のことについては何も触れられていない。理由は簡単で、それを明らかにするとFES1以外の別のES細胞を探さなければいけないからである。おそらく、それは見つからなかったのであろう。仮に混入させた人間がいたとしても129/GFP　ESがあるのにわざわざ別のES細胞を使う理由はないのである。

いずれにしても、STAP細胞がES細胞の混入によって作られたという根拠はこのFI幹細胞の存在により消失していると思うのである。

» 続きを読む