上記の広告は1ヶ月以上更新のないブログに表示されています。
    新しい記事を書く事で広告が消せます。
    --.--.-- -- l スポンサー広告 l top
    FI幹細胞で共培養していたなら、STAP幹細胞も共培養していてたのではないかと考えることができる。

    公開された保全リストをみるとNo41~51の「FLB」の細胞株には「FLB-3 Sort」というように「Sort」という文字が全ての細胞株に書かれている。

    「FLB」というのは調査委員会が解析していない細胞株であるが、山梨大へのMTA(移管書)からSTAP幹細胞であることが分かっている。

    保全リストをみたとき、「Sort」の意味はFACSによるソート(選別)の意味だろうと思っていたが、STAP幹細胞に何故、「Sort」が必要か分からなかった。

    それに「FLB」の「B」もである。この「B」はBlastcyst(胚盤胞)の「B」である。「F」は129B6F1の「F」、「L」はLymphocyte(リンパ球)の「L」である。

    STAP細胞は生まれた仔マウスの脾臓を取り出して作っている。「F」と「L」はその意味を指しているが、そこに胚盤胞が出てくるのが不思議だった。

    しかし、「FLB」が胚盤胞の内部細胞塊を取り出し、STAP細胞と共培養して作ったSTAP幹細胞であったなら、「B」であり、「Sort」の文字が書かれているのは納得できる。

    「STAP細胞+内部細胞塊」→(ACTH+LIFで培養?)→STAP幹細胞+ES細胞」である。

    この「FLB」は2012年1月31日とFLSと同じ日に作成されている。そうだとすると、かなり早い段階から共培養して作られていたことになる。

    STAP幹細胞がSTAP細胞とES細胞で共培養されているなら、それはとりもなおさず、STAP細胞の存在を認めていたことになる。ES細胞をSTAP細胞だと騙して渡していたなんてことはもはやあり得ないのである。



    スポンサーサイト
    2016.09.17 Sat l STAP細胞事件 l コメント (10) トラックバック (0) l top
    なぜ、FI幹細胞にCD1のTS細胞が混在していたのかという答えがTs.Marker氏の「STAP+TS → FI-SC+TS なんてことを考えている。寺下さんの博論は当時の若山研でのことで、STAP実験に応用されてもおかしくない」である。

    寺下さんというのは寺下愉加里さんのことで、Letter論文の共著者にもなっている。

    博論には小保方氏に対する謝辞が書かれてあり、「あの日」で書かれた、「あと1年で博士の学位がとれる学生さんを一人預かっていた」とはこの寺下さんのことだろう。寺下さんは若山研が引っ越した2013年4月から1年間、小保方氏の下で研究していたことになる。

    FI幹細胞について調査委員会は、①若山氏は129B6F1マウス以外では作っていない②小保方氏は1回だけ作ったが解析には使わず保存もしなかったとしている。従って、2013年6月にGRASに持ち込んだOct4-GFPのFI幹細胞は寺下さんが作っていたと思われる。

    博論には共培養することによりクローン胚の品質改善を図ったことが書かれており、「集合法で 2 個または 3 個の胚を集合させることで正常な遺伝子発現をしている細胞数が増え、その後の発生に必要なボーダーラインを越えられていたのかもしれない」とある。

    それをFI幹細胞の作製に応用し、細胞数の少ないSTAP細胞を同様なTS細胞で補ったというのがTs.Marker氏の趣旨だろう。

    FI幹細胞はSTAP細胞をFGF4で培養して作るが、TS細胞も同様に栄養芽層(栄養膜細胞)をFGF4で培養して作る。「STAP細胞+栄養膜細胞(TS細胞)→(FGF4培養)→FI幹細胞+TS細胞」という図式である。

    その後、FI幹細胞とTS細胞をFACSを使ってOct4-GFP陽性細胞で選別すれば、Oct4-GFPを持つBOFマウスのFI幹細胞を取り出すことができる。

    FACSは蛍光抗体で染色した個々の細胞の蛍光を測定することができる機器で、解析するだけでなく特定の細胞だけを選別して取り出す(ソーティング)ことができるが、うまく選別出来ずに一部混ざったままで解析に出してしまったと思われる。

    この原因について、参考となる文言が調査委員会の報告書P24に書かれている。

    「小保方氏と関係者への聞き取り調査から、小保方氏は主にCDBに設置されていた装置(FACS Aria)を用いてFACS解析を行っていた。しかし、装置と技術に習熟する機会がないまま、実験を行っていたことを確認した。」

    操作に不慣れであったのが原因ではない可能性もあると思っているが、それはさておき、FI幹細胞の共培養の話はこれで終わったわけではない。これにはまだ続きがある。

    2016.09.17 Sat l STAP細胞事件 l コメント (0) トラックバック (0) l top
    最近、なるほどなーと感心したことがある。

    「DORAのブログ」のTs.Marker氏のコメントのことだが、そこには「STAP+TS → FI-SC+TS なんてことを考えている。寺下さんの博論は当時の若山研でのことで、STAP実験に応用されてもおかしくない。」と書かれていた。

    ES細胞による捏造説の根拠の一つに、FI細胞を解析するとES細胞とTS細胞の混ぜ物だったというのがある。TS細胞は胎児だけでなく胎盤にも寄与するので、2つの細胞を混ぜ合わせればFI幹細胞になるというものだ。

    調査委員会はそれらを「B6 Oct4-GFP」+「α(CD1の可能性が高い)」とし、一方、遠藤氏も公開データにより9割のB6マウスのES細胞と1割のCD1マウスのTS細胞が混ざったものだと解析している。

    この公開データは若山研が引っ越した後の2013年6月にCDBゲノム資源解析ユニット(GRAS)に持ち込まれたときのものである。このため、小保方氏が捏造したという根拠の一つにもなっていた。

    TS特異遺伝子


    遠藤氏の解析ではSall4およびKlf4のようなES細胞で発現する遺伝子にあるSNPはB6タイプしかないが、TS細胞で特異的に発現するElf5およびSox21遺伝子は非B6タイプの発現があり、別マウスのTS細胞のものだという。

    ここで着目しているSNPは発現遺伝子の中のSNPでB6かそうでないかを確実に識別できるSNPと思われる。B6ならB6と分かり、B6でないならB6以外と分かるSNPである。そうでなければ、そこに着目する意味がない。

    ES細胞で発現する遺伝子のSall4およびKlf4遺伝子を発現しているのはB6だけなので、発現しているのはGOFマウスのB6ホモの細胞だと思われるが、TS細胞の特異遺伝子ではB6以外のSNPがあり、それを発現する他の細胞があることになる。その混じっているのが白いCD1マウスのTS細胞だということになる。

    しかし、B6タイプでもTS細胞の特異遺伝子を発現している。B6と非B6の割合がバラバラで一定ではないのでB6×CD1のF1マウスの細胞による発現ではないだろう。二つの細胞がそれぞれ発現しているとみるのが妥当だと思われる。

    つまり、ES細胞の特異的遺伝子を発現するB6はTS細胞の遺伝子を共に発現していることになる。これは、まさに論文に書かれていたが見つからなかったOct4-GFPを持つFI幹細胞だったということになる。

    結局、遠藤氏がES細胞とTS細胞の混ぜ合わせでFI幹細胞はないとする論文が逆に、FI幹細胞の存在を示すという皮肉なことになっているのである。


    2016.09.17 Sat l STAP細胞事件 l コメント (0) トラックバック (0) l top
    以前のエントリー「石川氏は小保方氏が若山夫人のES細胞を盗み、STAP細胞を捏造したと告発していた」で、若山夫人が盗まれたとするES細胞は、「129/GFP ES」だと書いた。

    石川氏を納得させ、告発に踏み切らせたとすれば、同じアクロシン入りの129B6F1のES細胞を若山夫人が持っていたことが前提になるからだ。

    それが何なのか分からなかったが、大田論文を調べていくなかで、これだろうというES細胞にたどり着いた。

    若山夫人が2004年8月に「Biology of Reproduction」に投稿した論文に「Establishment of Male and Female Nuclear Transfer Embryonic Stem Cell Lines from Different Mouse Strains and Tissues」がある。

    この論文には7つの異なるオスとメスマウスの遺伝子型と3つの細胞型(卵丘細胞核、雌尾先端細胞核、セルトリ細胞核)を核ドナーとして核移植ES細胞を作り、その樹立効率を調べたことが書かれている。

    この7つの核移植ドナーになったのは①B6D2F1 (C57BL/6 × DBA/2)、②B6C3F1 (C57BL/6 × C3H/He)、③C57BL/6 、④C3H/He、⑤DBA/2、⑥GFP入りB6D2F1 、⑦GFP入り129B6F1のマウスである。従って、出来たES細胞はそれら7種の核移植ES細胞だったことになる。

    一方、大田氏は2005年3月、同じ「Biology of Reproduction」に出生直後に死亡したクローンマウスの精巣細胞を取り出し、免疫不全マウスの精巣に移植して、成長させた精子を使って卵細胞質内精子注入法(ICSI:卵細胞に精子を注入)で子どもを作ったという論文を投稿している。

    クローンマウスは未受精卵を取り出して核を除去、替りにドナーの体細胞の核を移植(受精卵もどきになる)し、疑似妊娠させたマウスの子宮に戻して作る。その過程で胚盤胞を取り出し、培養したのが核移植ES細胞である。

    大田氏は論文でクローンマウスのドナーに129+Terマウスと岡部B6マウス(アクロシンGFP入り)を掛け合わせた129B6F1マウスセルトリ細胞を使ったと書いている。

    若山夫人の論文の第二著者は大田氏である。おそらく、若山夫人の論文に書かれたこの⑦はそのクローンマウスを作る過程で大田氏が作った核移植ES細胞だったと思われる。

    それなら、「⑦GFP入り129B6F1」のGFPとはアクロシンGFPである。

    石川氏が「若山研のスタッフから詳細な説明を受け、膨大な証拠を手に入れた」とあるのは、おそらくそのことだろう。石川氏は、それが小保方研にあった「129/GFP ES」の正体だと思い、自信満々で告発したものと思われる。

    それを警察は氏名不詳に変更させ受理した。警察が石川氏の告発を受理したのは、盗まれたとする若山夫人のES細胞がSTAP細胞の捏造に使われたと告発したからである。それが無関係なES細胞であったのなら、受付さえしてもらえなかったはずである。

    しかし、実際には、⑦は白色マウスの129X1ではなく茶色の129+Terマウスで、受精卵ES細胞ではなく核移植ES細胞で、「129/GFP ES」とは全く関係のないしろものであった。そのため、神戸地検が「事件の発生自体が疑わしい」として幕を引いたということだろう。





    2016.09.08 Thu l STAP細胞事件 l コメント (4) トラックバック (0) l top
    犯人が受精卵ES細胞、FES1をFLS3とすり替えるときには困ったことが起きる。

    同じ種類のES細胞、FES2があり、そのままではFES1とFES2が全く違うES細胞になってしまう。かといって、FES2も同じようにFLS3とすり替えると、今度は受精卵ES細胞なのに全く同じになってしまう。受精卵ES細胞は子どもが一人ひとり違うように一つ一つ違うのである。

    京大で保管されてあったES細胞にそのようなおかしな操作をすると自分が疑われてしまう。そこで犯人はFES2にFLS3を混ぜたのである。FLS3はSTAP幹細胞であるが、どちらも同じ性質を持ち培養方法も同じである。混ぜ物だとは分からないはずである。

    その混ぜ合わせの痕跡が「近縁率表」に残っている。

    近縁率表2

    FES1とntESG1の近縁率は4.29%である。ところが、FES2とntESG1の近縁率は72.04%と跳ね上がる。FES2はFES1と凍結日が同じで、2005年の論文のときに作られた同じ種類の受精卵ES細胞のはずである。このような差がでるのは、同じ種類のES細胞では考えられないことである。

    FLS3とFES2の混ぜ合わされた細胞株を培養して、全ゲノム解析をするとどのようになるだろうか。

    FLS3とFES2が8対2の混合であるとして、ゲノム解析すると全てがFLS3のゲノムパターンになることはないはずである。一部のゲノムはFES2パターンになるはずである。

    ここで、「近縁率表」で比較しているSNPsがどういうSNPsだったかというと、FES1とFES2で違うSNPsを比較していた。FES1がFLS3で、FES2がFLS3とFES2の混ぜ物であれば、違うSNPsは本来のFES2とFLS3が違っているFES2の部分だということになる。

    このFES2の部分についてFLS3であるFES1とntESG1を比較するとFES1は129X1でntESG1は129+Terであるから、一致するところは少ない。しかし、FES2とntESG1を比較するとFES2はオスメス違うが同じ129+Terであるから、一致するSNPsが多くなる。これが両者の近縁率が大きく違っている理由である。

    近縁率の差

    これは調査委員会が解析したSNPsパターンをみてもはっきりと表れている。FES2がFLS3でない部分はほぼ、ntESG1と同じパターンになっているのである。

    12番染色体比較

    FES2が129X1と解析されたのは、混合比でFLS3の方が多かったからである。129X1を示すSNPsが多く、そのため129X1と解析されたと思われる。

    そして、FES1で見られた染色体3番と8番の欠失がFES2で見られなかったのは、その欠失の部分ではFES2が検出され、欠失が消えるからである。

    これで、過不足なく妨害工作の証明は出来ているはずである。


    2016.09.03 Sat l STAP細胞事件 l コメント (0) トラックバック (0) l top
    FES1はFLS3だという仮説を裏付ける記事が日経サイエンス2015年3月号にある。

    若山氏が使っているのはSLC社の白マウス129X1で、大田氏が好んで用いたのはクレア社の茶色マウス129+Terだ。論文に書かれていたのはクレア社の129+Terだったが、遠藤氏はSTAP論文のNGSデータから、FLSの親マウスは129X1だと予測した。

    結局、調査委員会は遠藤氏の予測通り、FES1は129X1だったとしている。

    京大細胞

    大田氏が若山研に来たのは2004年、そしてFES1が凍結保存されたのが2005年12月である。

    日経サイエンスがいう論文とは、2005年3月8日に大田氏が「BIOLOGY of REPRODUCTION」に投稿した「Generation of Normal Progeny by Intracytoplasmic Sperm Injection Following Grafting of Testicular Tissue from Cloned Mice That Died Postnatally」(出生後に死亡したクローンマウスの精巣組織を移植後、卵細胞質内精子注入法(ICSI)によって正常な子孫を作製)のことだと思われる。

    大田氏は2004年3月にも「Journal of Reproduction and Development」に投稿しているが、そのとき使用したマウスは全て、静岡実験動物センターのものであり、129系統のマウスは使用していない。

    その2005年3月の論文では、使用マウスについて次のように書いている。

    未成熟なB6C3F1オスマウス、成人ICRメスマウス、および成人BDF1メスマウスは、静岡実験動物センター(浜松、日本)から購入しました。129 / SV-TerメスマウスおよびオスのICRヌードマウスを、それぞれ日本クレア社、そして日本チャールス・リバー社から購入しました。

    ここでは129/SV-Terと書かれているが、日本クレア社では「129+Ter/SVJcl」と「+」表記している。

    この論文には129+Terメスマウスと岡部B6オスマウスを掛け合わせた129B6F1マウスを核移植のドナーとしたことが書かれている。FES1はこのとき作った受精卵ES細胞で、結局、使わずに凍結保存されたということだろう。

    さて、このように論文で丁寧に記述されている茶色の129+Terメスマウスが、実は別会社(SLC社)の白い129X1メスマウスだったというのはあり得ない話である。

    解析されたFES1は大田氏が作ったES細胞ではなかった。

    それは129X1マウスと岡部B6マウスの掛け合わせで生まれた仔マウスから小保方氏がSTAP細胞を作り、若山氏がSTAP幹細胞にしたFLS3に他ならなかったのである。

    次回はまた「近縁率表」に戻って、妨害工作の全容を明らかにしたい。



    2016.09.01 Thu l STAP細胞事件 l コメント (8) トラックバック (0) l top
    上記広告は1ヶ月以上更新のないブログに表示されています。新しい記事を書くことで広告を消せます。